Unsere Publikationen und Poster

From Linear Synthesis to Ligation
Comparative Insights into Long Nucleic Acid Production

Florian Schäfer, Philipp Kamm

Zusammenfassung:

Als weltweit führender Hersteller von sgRNA ist BioSpring bestrebt, die Grenzen der RNA-Synthese kontinuierlich zu verschieben. Mit der Entwicklung anspruchsvollerer Geneditierungsverfahren steigt der Bedarf an immer längeren modifizierten RNA-Molekülen. Dadurch stößt die klassische lineare Festphasensynthese sowohl technisch als auch wirtschaftlich zunehmend an ihre Grenzen.

Die Fragmentligation bietet eine leistungsfähige Alternative zur linearen Synthese der vollständigen Sequenz. Dabei werden kürzere, chemisch synthetisierte RNA-Fragmente enzymatisch miteinander verknüpft. Dieses Verfahren kann dazu beitragen, den wachsenden Bedarf an längeren und komplexeren RNA-Molekülen zu decken. Um das volle Potenzial beider Ansätze auszuschöpfen, ist jedoch ein genaues Verständnis der jeweiligen Vor- und Nachteile entscheidend.

Comprehensive Analysis of Oligonucleotide Gasphase Stability and Fragmentation: Impact of 2'-Modification, Base Composition and Charge States

Christopher Gawlig, Mattis Kaumann, Güngör Hanci, Barbara K. Pfaff, Michael Rühl

Zusammenfassung:

Die Massenspektrometrie (MS) ist angesichts der wachsenden Bedeutung nukleinsäurebasierter Therapeutika zu einem unverzichtbaren Verfahren für die Charakterisierung von Oligonukleotiden geworden. Die Analyse der intakten Masse wird in der Qualitätskontrolle häufig zur Bestätigung der Molekülmasse eingesetzt, liefert jedoch keine sequenzspezifischen Informationen.

Die Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS) schließt diese Lücke, da sie die Identifizierung von Fragmentionen ermöglicht, die für das Oligonukleotidrückgrat charakteristisch sind. 

Unter den verfügbaren Fragmentierungstechniken ist die kollisionsinduzierte Dissoziation (CID) aufgrund ihrer breiten Kompatibilität und Zuverlässigkeit nach wie vor am weitesten verbreitet. In dieser Studie wurde die Fragmentierung von Oligonukleotiden unter CID-Bedingungen systematisch untersucht. 

Zusätzlich wurde die Bildung sequenzinformativer c-Ionen in Abhängigkeit vom Verbrauch des Vorläuferions untersucht. Ein intern entwickeltes Python-basiertes Auswertungstool ermöglichte die effiziente Verarbeitung und Visualisierung von mehr als 1.000 Einzelspektren und damit eine hochauflösende Interpretation des Verhaltens von Vorläufer- und Fragmentionen bei unterschiedlichen CID-Spannungen.

Utilizing Size Exclusion Chromatography as Universal Quality Control Analysis for Gene Therapeutics

Rebecca Hirschberger, Felix Pawel, Barbara Pfaff, Michael Rühl

Zusammenfassung:

In den vergangenen Jahren hat in-vitro-transkribierte (IVT) messenger-RNA (mRNA) als vielversprechende Wirkstoffklasse zur Übertragung genetischer Information stark an Bedeutung gewonnen. Mit dem wachsenden Interesse an pharmazeutischen Anwendungen steigt der Bedarf an zuverlässigen analytischen Methoden für diese Substanzklasse. Linearisierte Plasmide spielen bei der pharmazeutischen Herstellung von mRNA durch IVT eine zentrale Rolle, da sie als DNA-Matrizen dienen.

Dazu werden zirkuläre Plasmide mit der gewünschten Sequenz hergestellt und mithilfe von Restriktionsenzymen linearisiert. Nach erfolgreicher IVT entsteht daraus die finale mRNA. Die hier vorgestellte Größenausschlusschromatographie (SEC) erweist sich als wirksame Methode, um lineare und zirkuläre Plasmide größenbasiert zu trennen und die Länge von mRNA zu bestimmen.

Investigation of IEX-HPLC for single base resolution sgRNA quality control

Demonstrating a time-saving approach for good seperation in drug development 

Patrick Seyfried, Sven Warhaut, Florian Schäfer

Zusammenfassung:

Mit der Marktzulassung von Casgevy® Ende 2023 hat CRISPR-Cas9 seine Eignung als therapeutische Option unter Beweis gestellt. Unternehmen, die Single-Guide-RNA (sgRNA) als Wirkstoff entwickeln, müssen deren kritische Qualitätsmerkmale zuverlässig kontrollieren. Neben anderen Verfahren gilt die HPLC als Goldstandard für die hochauflösende Trennung langer Oligomere. Die Sequenz des Oligomers und die enthaltenen Modifikationen beeinflussen die Trennung von Verunreinigungen maßgeblich.

Daher lassen sich keine universellen Methoden entwickeln, die für alle Moleküle eine ausreichende Auflösung bieten und Verkürzungen um nur ein Nukleotid zuverlässig trennen. Die Entwicklung individueller Methoden ist somit unvermeidbar und in der Qualitätskontrolle häufig zeitaufwendig, komplex und kostenintensiv.

ATR-FTIR spectroscopy: A versatile tool for incoming quality control measurements

Jens Neumann, Lena Rindermann, Jonas Watzel

Zusammenfassung:

Die Bestätigung der Materialidentität (ID) ist ein routinemäßiger Bestandteil der Wareneingangskontrolle (QC). Sie verhindert, dass verunreinigte oder falsch gekennzeichnete Materialien in die Produktion gelangen. Die abgeschwächte Totalreflexions-Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie (ATR-FTIR) ist hierfür in der pharmazeutischen Industrie ein etabliertes Verfahren, da sich damit eine große Bandbreite an Proben, etwa Flüssigkeiten, Feststoffe und Pulver, schnell und einfach analysieren lässt.

Going Green - Sustainability Solutions in Oligonucleotide Manufacturing

Patrick Seyfried, Sven Warhaut, Florian Schäfer

Zusammenfassung:

Oligonukleotide haben sich in kurzer Zeit zu einer der weltweit gefragtesten Wirkstoffklassen entwickelt. Seit mehr als 40 Jahren ist die Festphasensynthese nach der Phosphoramidit-Methode das bevorzugte Upstream-Verfahren. Aus Nachhaltigkeitssicht bringt sie jedoch verschiedene Herausforderungen mit sich, darunter eine ungünstige Process Mass Intensity (PMI).

Mit zunehmenden Chargengrößen und Produktionsvolumina wird es immer wichtiger, die Herstellung von Oligonukleotiden nachhaltiger zu gestalten und ihren ökologischen Fußabdruck zu reduzieren.

MS/MS Quantification of therapeutic oligonucleotides via isobaric internal standard

Güngör Hanci, Michael Rühl, Christopher Gawlig

Zusammenfassung: 

Mit der in den vergangenen Jahren gestiegenen Nachfrage nach therapeutischen Oligonukleotiden ist deren qualitative und quantitative analytische Charakterisierung zu einem zentralen Bestandteil der Analytik geworden. Für die Quantifizierung von Oligonukleotiden stehen verschiedene Verfahren zur Verfügung, darunter Flüssigchromatographie, Hybridisierungs-ELISA (hELISA) und Polymerase-Kettenreaktion (PCR).

Besonders anspruchsvoll ist die quantitative Analyse von Oligonukleotiden in Bioflüssigkeiten und Geweben. Hier beschreiben wir die Anwendung unserer bereits veröffentlichten MS/MS-Quantifizierungsmethode anhand zweier therapeutischer Oligonukleotide: eines 20 Nukleotide langen Antisense-Oligonukleotids und eines 28 Nukleotide langen Aptamers. Die Quantifizierung erfolgt mittels Multiple-Reaction-Monitoring (MRM) unter Verwendung isobarer interner Standards.

Die Standards basieren auf dem jeweiligen Analyten und unterscheiden sich lediglich durch den Austausch einer Base in der Sequenz, wodurch ihr isobarer Charakter entsteht. Wir zeigen, dass die Kombination isobarer interner Standards mit der MRM-Analyse bei mittleren Analytkonzentrationen von 1-100 µg/ml eine gute Richtigkeit, Wiederfindung und Linearität ermöglicht. Mit einem hochauflösenden qTOF-System wurden zudem Bestimmungsgrenzen (LLOQ) von 20-50 ng/ml erreicht.

Comprehensive investigation of parameters influencing oligonucleotide mass spectra following IP-RP separation and negative polarity ionization

Till Wehner, Laura Steinhauer, Christopher Gawlig, Michael Rühl

Zusammenfassung: 

Therapeutische Oligonukleotide werden kontinuierlich für die Behandlung erblicher Erkrankungen weiterentwickelt. Unternehmen, die solche Wirkstoffe entwickeln, müssen daher die Identität der Moleküle sicherstellen und Verunreinigungen sowie Abbauprodukte untersuchen und kontrollieren. Die Massenspektrometrie gilt als Goldstandard zur Bestimmung kritischer Qualitätsmerkmale. Die Ladungszustandsverteilung von ESI-MS-Spektren wird sowohl durch das Eluentensystem als auch durch die Parameter der Ionenquelle stark beeinflusst.

Diese Studie untersucht die Auswirkungen von zwölf Eluentensystemen sowie der Ionenquellenparameter Cone-Spannung, Desolvationstemperatur und Kapillarspannung auf die Massenspektren von Oligonukleotiden mit Längen zwischen 20 und 200 Nukleotiden.

OligoSeq: NextGen Im-/Purity Profiling Oligo Characterization by Next Generation Sequencing

Barbara Karolina Pfaff, Julius Buss, Ruven Jilly

Zusammenfassung: 

Single-Guide-RNAs (sgRNAs) sind für zielgerichtete Therapeutika von großer Bedeutung, insbesondere beim Genome Editing mit dem CRISPR-Cas9-System. Sie eröffnen personalisierte Behandlungsansätze für genetische Erkrankungen, Krebs und Virusinfektionen. Eine zuverlässige Qualitätskontrolle ist daher entscheidend. Next-Generation-Sequencing (NGS) kann ein umfassendes Bild der Oligonukleotidreinheit liefern.

Eine Ultra-Deep-NGS-Methode mit mindestens zwei Millionen Reads pro Probe wird mit einem bioinformatischen Auswertungstool kombiniert und ermöglicht die Charakterisierung sequenzbasierter Verunreinigungen und Varianten. Gemeinsam mit der ecSeq Bioinformatics GmbH wurde dafür eine maßgeschneiderte Pipeline namens "Oligo Impurity Profiling Analysis" entwickelt. Der Ansatz klassifiziert die Zusammensetzung von Oligonukleotiden anhand von Verkürzungen, Verlängerungen und Sequenzvarianten.

Die Ergebnisse werden interaktiv dargestellt und liefern detaillierte Einblicke in Sequenz- und Längenvarianten. Der NextGen-Ansatz zur Reinheits- und Verunreinigungsprofilierung ermöglicht eine präzise Bewertung der Sicherheit synthetischer Oligonukleotide für therapeutische Anwendungen.

In vitro single guide RNA activity assay in regulated environment for quality control purposes

Christian Sattler, Felix Bade, Aref Shahnazari, Andela Juric, Julia Kraus, Michael Rühl

Zusammenfassung: 

Die Entdeckung des bakteriellen Abwehrsystems gegen Phagen, CRISPR/Cas, hat die genetische Forschung grundlegend verändert. Seine Anwendung ermöglicht die einfache und präzise genetische Veränderung von Zielzellen, vom Genome Editing bis zu therapeutischen Ansätzen [1]. Zentrales Element ist die etwa 100 Nukleotide lange Single-Guide-RNA (sgRNA) mit einer zielspezifischen Erkennungsregion von 20 Nukleotiden.

Die sgRNA bildet mit der Cas9-Endonuklease einen Ribonukleoprotein-Komplex (RNP). Dieser erkennt die gewünschte DNA-Zielsequenz, an der Cas9 einen Doppelstrangbruch erzeugt. Anschließend kann die Zielzelle die Schnittstelle über ihre Reparaturmechanismen mit neuer DNA auffüllen; alternativ lassen sich unerwünschte DNA-Sequenzen gezielt entfernen. Kürzlich erhielt die erste auf einer CRISPR/Cas9-Stammzelltherapie basierende Behandlung eine Zulassung [2].

Das große therapeutische Potenzial dieser Technologie erfordert belastbare Informationen über die sgRNA, beispielsweise zur Sequenzbestätigung, Reinheit und Aktivität im Zusammenspiel mit Cas9. Während Sequenz und Reinheit üblicherweise mit LC-MS-Verfahren bestimmt werden, ist für die Aktivitätsmessung der sgRNA ein enzymatischer Assay mit geeigneter Analytik erforderlich.

Wir haben einen enzymatischen In-vitro-Aktivitätsassay entwickelt, der auf Plasmid-Ziel-DNA und kapillarelektrophoretischer Analyse basiert und die sgRNA-abhängige Aktivität in einem regulierten QC-Umfeld bestimmt. Die Zielsequenz ist auf einem Plasmid kodiert, das mit dem RNP inkubiert wird. Das RNP schneidet die Ziel-DNA an der vorgesehenen Stelle in zwei Fragmente. Mithilfe der Kapillarelektrophorese werden die Spaltleistung und damit die Aktivität des RNP gemessen.

Aus den gewonnenen Daten lässt sich die Schnitteffizienz des RNP berechnen.

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